Polymerase Chain Reaction – de PCR techniek uitgelegd
Een veelgebruikte techniek in het laboratorium van bijvoorbeeld ziekenhuizen, medische universiteiten of fabrieken waar voeding of water wordt verwerkt en onderzocht, is de PCR. Deze relatief jonge onderzoeksmethode – ontwikkeld begin jaren tachtig – is revolutionair geweest voor het aantonen en ontdekken van organismen als bacteriën en virussen. Voor het opsporen en onderzoeken van genetisch materiaal bij forensisch onderzoek is de PCR techniek eveneens cruciaal voor het vinden van een dader.
Sinds de coronapandemie van 2019 wordt er veel gesproken in journaals en aanverwante informatieve programma’s over de PCR test voor SARS-COV-2: het type coronavirus dat verantwoordelijk is voor de ziekte COVID. Maar wat is de PCR nou precies en hoe werkt het dan? De afkorting PCR staat voor Polymerase Chain Reaction. Polymerase is een enzym, chain is het Engelse woord voor ‘ketting’ en het woord reaction is makkelijk te vertalen naar ‘reactie’.
Het is dus een kettingreactie die wordt aangestuurd door een bepaald enzym, namelijk polymerase. Voor het uitleggen om welke kettingreactie het gaat, moeten we terug naar de basis en dat is de drager van al het erfelijk materiaal: het DNA. Iedere cel van een levend organisme bevat DNA (danwel een afgeleide daarvan) en is opgebouwd uit een viertal verschillende bouwsteentjes: adenine (A), thymine (T), guanine (G) en cytose (C). Die bouwsteentjes kunnen in oneindig veel combinaties gekoppeld worden aan elkaar en die combinaties zorgen uiteindelijk voor de erfelijke eigenschappen. Op zo’n streng DNA – die opgebouwd is uit die bouwsteentjes – zal veel erfelijke informatie overeenkomen met een soortgenoot. Echter, er zijn altijd stukjes (dat noemen we een gen) op de streng DNA die heel specifiek zijn. De ene bacterie kan bijvoorbeeld overleven in een zure omgeving en de andere niet. De zuurliefhebbende bacterie zal stofjes aanmaken die zorgen dat het zich lekker voelt en het zuur niet de celwand aantast, terwijl een andere bacterie – die wel een familielid is – dat niet kan en niet zal overleven in een zuur milieu.De PCR techniek maakt gebruik van het opsporen van die stukjes DNA die heel specifiek zijn. Het is als het zoeken van een speld in een hooiberg met verschillende soorten spelden, waarmee je met een hele sterke magneet toch die ene speciale speld eruit kan trekken. Het probleem bij DNA is dat je één zo’n stukje streng niet kan zien en daarvoor is die kettingreactie ontwikkeld. Er worden miljoenen kopieën gemaakt van dat ene stukje specifieke DNA en met een ingebouwd trucje gaan fluorescerende moleculen wel of niet aan. En de mate van fluorescentie is wél te meten met bepaalde apparatuur.
Het principe van de Polymerase Chain Reaction
Het doel van de PCR reactie is het vermenigvuldigen van het specifiek stukje erfelijk materiaal en het resultaat meetbaar te maken met behulp van fluorescentie.
Daarvoor zijn een aantal onderdelen nodig die bij elkaar in een reactievaatje worden gestopt:
- Geïsoleerd DNA: DNA dat vrijgemaakt is uit cellen die aanwezig zijn in bijvoorbeeld water, bloed of melk
- De bouwsteentjes: adenine, thymine, guanine en cytose
- Primers: Fragmentjes DNA die plakken aan het begin en het eind van het te kopiëren stukje erfelijk materiaal. Aan deze primers zitten de fluorescerende vlaggetjes gekoppeld die ‘uit’ staan als er niks mee gebeurt in de reactie.
- Enzym: Het enzym polymerase die de A, T, C en G bouwsteentjes aan de primers op de goede volgorde kan koppelen
- Buffer: Dit is een vloeistof waar alle componenten in opgelost zijn en die zorgt voor een optimale omgeving om de reactie in plaats te laten vinden
Het proces van kopiëren bestaat uit een cyclus van stappen die meerdere malen wordt herhaald. Over het algemeen zijn 40 tot 45 maal het herhalen van de cyclus voldoende voor het produceren van miljarden kopieën. Reken maar uit: als je uitgaat van één stukje DNA heb je na de eerste cyclus twee kopieën, na de derde cyclus zijn dat er vier, daarna acht, zestien, etc. Het reactievaatje met alle componenten worden in een apparaat geplaatst die heel nauwkeurig en snel kan opwarmen en afkoelen. Eén cyclus bestaat (over het algemeen) uit:
- Denatureren DNA: DNA is opgebouwd uit de bouwsteentjes A, T, C en G en deze vormen een dubbele streng DNA. Deze verbindingen moeten uit elkaar getrokken worden en dat kan door de temperatuur te verhogen naar 90 tot 96°C.
- Zodra de strengen gescheiden zijn kunnen de primers gaan hechten aan het begin en eind van het stukje DNA dat aangetoond moet worden. Daarvoor wordt de temperatuur teruggebracht naar 45 tot 65°C.
- Nu is het de beurt aan het enzym polymerase om bij een temperatuur van 72°C de A, T, C en G bouwstenen te koppelen vanaf de aangehechte primers. De kopie wordt gemaakt!
Na elke cyclus registreert het apparaat hoeveel fluorescentie gemeten wordt. Als de primers niet het specifieke stukje DNA kan vinden, gebeurt er eigenlijk niks tijdens al die cycly. Het fluorescerende molecuul dat aan de primer vastzit blijft ‘uit’. Wanneer er wel een reactie plaatsvindt, zorgt het enzym polymerase ervoor dat tijdens het kopiëren dat molecuul losgekoppeld wordt. Het molecuul gaat dan licht uitzenden en die is te meten bij een bepaalde golflengte door het PCR apparaat. De regel bij analyseren is: hoe meer fluorescentie er gemeten wordt, hoe meer moleculen er aanwezig waren bij de start van de kopieerprocedure. De analist leest bij een kwalitatieve bepaling – is het te onderzoeken DNA aanwezig ja of nee – de Ct (threshold) waarde af. Deze waarde staat voor de cyclus waar het apparaat begint met het detecteren van de fluorescentie. Een lage Ct waarde betekent dus dat er veel specifiek materiaal in het geïsoleerde monster aanwezig was, maar er kan niks gezegd worden over exacte hoeveelheden. Er zullen ook situaties zijn waarbij het belangrijk is om niet alleen te weten óf een specifiek stukje DNA aanwezig is in het monster, maar ook hoeveel. Dat noemen we een kwantitatieve PCR – ook wel qPCR. Hiervoor moet naast het te onderzoeken monster ook een serie worden ingezet waarbij de concentraties bekend zijn en er een ijklijn wordt bepaald. Aan de hand van die ijklijn kan er berekend worden wat de beginconcentratie in het reactievaatje met geïsoleerd DNA aanwezig was.
Een groot voordeel van de PCR techniek is dat het in theorie maar één stukje specifiek DNA nodig heeft om de reactie te starten en dus heel gevoelig is. Dus je kan in tien liter water nét die ene Legionellabacterie opsporen die mogelijk een ziekte kan veroorzaken. Of je kan die hele moeilijk te kweken tuberculoseveroorzaker aantonen in opgehoest slijm van de patiënt. In sommige gevallen is het nadeel dat je echter niet kan aantonen of het gaat om een nog levend organisme of dat je een DNA fragment analyseert van een virus of bacterie die eigenlijk allang niet meer een ziekte kan veroorzaken omdat het dood is. Daar wordt over het algemeen geen onderscheid in gemaakt in de reactie. Deze discussie is bij het aantonen van het coronavirus veelvuldig aangezwengeld in de media en heeft voor veel verwarring en kritiek gezorgd met betrekking tot het inzetten van deze techniek voor het aantonen van het virus in een neus- en/of keeluitstrijkje. Indien er een hoge Ct waarde is en er weinig beginmateriaal aanwezig was van het – in dit geval – coronavirus, is er dan nog sprake van besmettelijkheid? En kan het ook zo zijn dat je met de PCR virusdeeltjes mist of dat de uitslag positief is, terwijl er geen virus aanwezig was?
De kans dat je een vals positieve uitslag krijgt bij een PCR test is vrij klein. De kans op een vals negatieve test is wel groter. Dit komt omdat er veel meer kans is dat er fouten worden gemaakt bij de afname van het monster, het transport of tijdens handelingen in het laboratorium. Het is dus niet de PCR test die per se vals negatieve uitslagen zal geven, maar door alle acties eromheen. Indien je de beschikking hebt over een PCR test en apparatuur om ziekteverwerkers aan te tonen, zullen de meeste laboratoria voor deze techniek kiezen.
Marije, Hoofdlaborant.
