Polymerase-Kettenreaktion – die PCR-Technik erklärt
Eine häufig verwendete Technik in den Labors von Krankenhäusern, medizinischen Universitäten oder Fabriken, in denen z.B. Lebensmittel oder Wasser verarbeitet und untersucht werden, ist die PCR. Diese relativ junge Forschungsmethode – entwickelt in den frühen 1980er Jahren – war revolutionär für den Nachweis und die Untersuchung von Organismen wie Bakterien und Viren. Auch für den Nachweis und die Untersuchung von genetischem Material bei forensischen Untersuchungen ist die PCR-Technik entscheidend, um einen Schuldigen zu finden.
Seit der Corona-Pandemie 2019 wird in den Nachrichten und den entsprechenden Informationssendungen viel über den PCR-Test für SARS-COV-2 gesprochen: den Typ des Coronavirus, der für die Krankheit COVID verantwortlich ist. Aber was genau ist der PCR-Test und wie funktioniert er? Die Abkürzung PCR steht für Polymerase Chain Reaction. Polymerase ist ein Enzym, chain ist das englische Wort für ‘Kette’ und das Wort reaction lässt sich einfach mit ‘Reaktion’ übersetzen.
Es handelt sich also um eine Kettenreaktion, die durch ein bestimmtes Enzym, nämlich die Polymerase, angetrieben wird. Um zu erklären, um welche Kettenreaktion es sich handelt, müssen wir zu den Grundlagen zurückkehren und das ist der Träger allen Erbguts: die DNA. Jede Zelle eines lebenden Organismus enthält DNA (oder ein Derivat davon) und ist aus etwa vier verschiedenen Bausteinen zusammengesetzt: Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytose (C). Diese Bausteine können in einer unendlichen Anzahl von Kombinationen miteinander verknüpft werden und diese Kombinationen sorgen letztendlich für die vererbbaren Eigenschaften. Auf einem solchen DNA-Strang – der aus diesen Bausteinen besteht – werden viele Erbinformationen mit denen eines Artgenossen übereinstimmen. Es gibt jedoch immer Bits (Gen genannt) auf dem DNA-Strang, die sehr spezifisch sind. Ein Beispiel: Ein Bakterium kann in einer sauren Umgebung überleben, ein anderes nicht. Das säureliebende Bakterium wird Stoffe produzieren, mit denen es sich wohl fühlt und die Säure greift die Zellwand nicht an, während ein anderes Bakterium – das ein Verwandter ist – in einer sauren Umgebung nicht überleben kann und wird.Bei der PCR-Technik werden diejenigen DNA-Stücke nachgewiesen, die sehr spezifisch sind. Es ist wie die Suche nach einer Nadel im Heuhaufen mit verschiedenen Arten von Stecknadeln, bei der man mit einem sehr starken Magneten immer noch diese eine spezielle Nadel herausziehen kann. Das Problem bei der DNA ist, dass man ein solches Stück Strang nicht sehen kann und deshalb wurde diese Kettenreaktion entwickelt. Von diesem einen Stück spezifischer DNA werden Millionen von Kopien hergestellt und mit einem eingebauten Trick schalten sich fluoreszierende Moleküle ein oder aus. Und der Grad der Fluoreszenz kann mit bestimmten Geräten gemessen werden.
Das Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion
Der Zweck der PCR-Reaktion besteht darin, das spezifische Stück Erbmaterial zu vervielfältigen und das Ergebnis mit Hilfe von Fluoreszenz messbar zu machen.
Dazu sind eine Reihe von Komponenten erforderlich, die in einem Reaktionsgefäß zusammengefügt werden:
- Isolierte DNA: DNA, die aus Zellen freigesetzt wird, die z.B. in Wasser, Blut oder Milch vorhanden sind
- Die Bausteine: Adenin, Thymin, Guanin und Cytose
- Primer: DNA-Fragmente, die am Anfang und am Ende des zu kopierenden Stücks Erbmaterials haften. An diesen Primern sind fluoreszierende Flaggen angebracht, die ‘aus’ sind, wenn in der Reaktion nichts mit ihnen geschieht.
- Enzym: Das Enzym Polymerase, das die A-, T-, C- und G-Bausteine in der richtigen Reihenfolge mit den Primern verbinden kann
- Puffer: Dies ist eine Flüssigkeit, in der alle Komponenten gelöst sind und die eine optimale Umgebung für die Reaktion bietet.
Der Prozess des Kopierens besteht aus einem Zyklus von Schritten, die mehrmals wiederholt werden. In der Regel reicht eine 40- bis 45-malige Wiederholung des Zyklus aus, um Milliarden von Kopien zu erzeugen. Rechnen Sie nach: Wenn Sie von einem Stück DNA ausgehen, haben Sie nach dem ersten Zyklus zwei Kopien, nach dem dritten Zyklus sind es vier, dann acht, 16, usw. Das Reaktionsgefäß mit allen Komponenten befindet sich in einem Gerät, das sehr präzise und schnell aufheizen und abkühlen kann. Ein Zyklus besteht (im Allgemeinen) aus:
- Denaturierung der DNA: Die DNA besteht aus den Bausteinen A, T, C und G und diese bilden einen Doppelstrang der DNA. Diese Verbindungen müssen auseinandergezogen werden. Dies kann durch eine Erhöhung der Temperatur auf 90 bis 96°C geschehen.
- Sobald die Stränge getrennt sind, können die Primer beginnen, sich an den Anfang und das Ende des nachzuweisenden DNA-Stücks zu heften. Zu diesem Zweck wird die Temperatur auf 45 bis 65°C gesenkt.
- Jetzt ist das Enzym Polymerase an der Reihe, um die A-, T-, C- und G-Bausteine der angehängten Primer bei einer Temperatur von 72°C zu verknüpfen. Die Kopie ist gemacht!
Nach jedem Zyklus zeichnet das Gerät auf, wie viel Fluoreszenz gemessen wurde. Wenn die Primer das spezifische DNA-Stück nicht finden können, passiert während all dieser Zyklen eigentlich nichts. Das fluoreszierende Molekül, das an den Primer gebunden ist, bleibt ‘aus’. Wenn eine Reaktion stattfindet, sorgt das Enzym Polymerase dafür, dass sich dieses Molekül während des Kopierens abkoppelt. Das Molekül beginnt dann, Licht zu emittieren, das von dem PCR-Gerät bei einer bestimmten Wellenlänge gemessen werden kann. Bei der Analyse gilt die Regel: Je mehr Fluoreszenz gemessen wird, desto mehr Moleküle waren zu Beginn des Kopiervorgangs vorhanden. Bei einer qualitativen Bestimmung – ist die zu untersuchende DNA vorhanden ja oder nein – liest der Analytiker den Ct-Wert (Schwellenwert) ab. Dieser Wert stellt den Zyklus dar, bei dem das Gerät beginnt, Fluoreszenz zu erkennen. Ein niedriger Ct-Wert bedeutet also, dass viel spezifisches Material in der isolierten Probe vorhanden war, aber über die genaue Menge lässt sich nichts sagen. Es gibt auch Situationen, in denen es wichtig ist, nicht nur zu wissen, ob ein bestimmtes Stück DNA in der Probe vorhanden ist, sondern auch wie viel. Wir nennen dies eine quantitative PCR – auch bekannt als qPCR. Dazu muss neben der zu untersuchenden Probe eine Serie verwendet werden, bei der die Konzentrationen bekannt sind und eine Kalibrierungskurve bestimmt wird. Anhand dieser Kalibrierungslinie lässt sich berechnen, wie hoch die Ausgangskonzentration in dem Reaktionsgefäß mit der isolierten DNA war.
Ein großer Vorteil der PCR-Technik ist, dass sie theoretisch nur ein Stück spezifischer DNA benötigt, um die Reaktion zu starten, und daher sehr empfindlich ist. Sie können also ein einziges Legionellenbakterium in zehn Litern Wasser nachweisen, das möglicherweise eine Krankheit verursachen könnte. Oder Sie können den sehr schwer zu kultivierenden Tuberkulose-Erreger im abgehusteten Schleim des Patienten nachweisen. In manchen Fällen besteht der Nachteil jedoch darin, dass Sie nicht nachweisen können, ob der betreffende Organismus noch lebt oder ob Sie ein DNA-Fragment eines Virus oder Bakteriums analysieren, das eigentlich keine Krankheit mehr verursachen kann, weil es tot ist. Dies wird bei der Reaktion im Allgemeinen nicht unterschieden. Diese Diskussion wurde häufig in den Medien geführt, als das Coronavirus nachgewiesen wurde, und sorgte für viel Verwirrung und Kritik an der Anwendung dieser Technik zum Nachweis des Virus in einem Nasen- und/oder Rachenabstrich. Wenn ein hoher Ct-Wert vorliegt und wenig Ausgangsmaterial des – in diesem Fall – Coronavirus vorhanden war, ist dann noch Infektiosität vorhanden? Und könnte es auch sein, dass Sie bei der PCR Viruspartikel übersehen oder dass das Ergebnis positiv ist, obwohl kein Virus vorhanden war?
Die Wahrscheinlichkeit, dass ein PCR-Test ein falsch positives Ergebnis liefert, ist recht gering. Die Chance, einen falsch negativen Test zu erhalten, ist jedoch höher. Das liegt daran, dass bei der Probenentnahme, beim Transport oder bei der Arbeit im Labor viel mehr Fehler gemacht werden können. Es ist also nicht der PCR-Test, der zwangsläufig falsch-negative Ergebnisse liefert, sondern die ganzen Vorgänge, die ihn umgeben. Wenn Sie Zugang zu einem PCR-Test und einer Ausrüstung zum Nachweis von Krankheitserregern haben, werden sich die meisten Labors für diese Technik entscheiden.
Marije, Leiterin des Labors.
