Réaction en chaîne par polymérase – la technique PCR expliquée
La PCR est une technique couramment utilisée dans les laboratoires des hôpitaux, des universités de médecine ou des usines où les aliments ou l’eau sont traités et examinés, par exemple. Cette méthode de recherche relativement récente – mise au point au début des années 1980 – s’est révélée révolutionnaire pour la détection et l’identification d’organismes tels que les bactéries et les virus. Pour la détection et l’examen du matériel génétique dans les enquêtes médico-légales, la technique PCR est également cruciale pour trouver un coupable.
Depuis la pandémie de grippe aviaire de 2019, les journaux télévisés et les programmes d’information connexes ont beaucoup parlé du test PCR pour le SRAS-COV-2, le type de coronavirus responsable de la maladie COVID. Mais qu’est-ce que la PCR et comment fonctionne-t-elle ? L’abréviation PCR signifie Polymerase Chain Reaction (réaction en chaîne de la polymérase). Polymerase est une enzyme, chain est le mot anglais pour “chaîne” et le mot reaction se traduit facilement par “réaction”.
Il s’agit donc d’une réaction en chaîne entraînée par une enzyme particulière, la polymérase. Pour expliquer quelle réaction en chaîne est impliquée, nous devons revenir à l’essentiel, à savoir le support de tout le matériel héréditaire : l’ADN. Chaque cellule d’un organisme vivant contient de l’ADN (ou un dérivé de celui-ci) et se compose d’environ quatre éléments différents : l’adénine (A), la thymine (T), la guanine (G) et la cytose (C). Ces éléments peuvent être reliés entre eux dans un nombre infini de combinaisons, et ce sont ces combinaisons qui, en fin de compte, confèrent les propriétés héréditaires. Sur un tel brin d’ADN – qui est constitué de ces éléments de base – de nombreuses informations héréditaires correspondront à celles d’un congénère. Cependant, il y a toujours des éléments (appelés gènes) sur le brin d’ADN qui sont très spécifiques. Par exemple, une bactérie peut survivre dans un environnement acide alors qu’une autre ne le peut pas. La bactérie qui aime l’acide produira des substances qui lui font du bien et l’acide n’attaque pas la paroi cellulaire, tandis qu’une autre bactérie – qui est un parent – ne peut pas survivre dans un environnement acide et ne le fera pas.La technique PCR permet de détecter les morceaux d’ADN qui sont très spécifiques. C’est comme chercher une aiguille dans une botte de foin avec différents types d’épingles, dont vous pouvez toujours extraire cette épingle spéciale avec un aimant très puissant. Le problème avec l’ADN, c’est que vous ne pouvez pas voir un tel morceau de brin et c’est pourquoi la réaction en chaîne a été mise au point. Des millions de copies sont faites de ce morceau d’ADN spécifique et, grâce à une astuce intégrée, les molécules fluorescentes s’allument ou s’éteignent. Le degré de fluorescence peut être mesuré à l’aide de certains équipements.
Le principe de la réaction en chaîne par polymérase
L’objectif de la réaction PCR est de multiplier le matériel héréditaire spécifique et de rendre le résultat mesurable par fluorescence.
Cela nécessite un certain nombre de composants assemblés dans une cuve de réaction :
- ADN isolé : ADN libéré des cellules présentes, par exemple, dans l’eau, le sang ou le lait.
- Les éléments constitutifs : adénine, thymine, guanine et cytose
- Amorces : fragments d’ADN qui se collent au début et à la fin du morceau de matériel héréditaire à copier. Les drapeaux fluorescents sont attachés à ces amorces et sont éteints lorsqu’ils ne sont pas touchés par la réaction.
- Enzyme : l’enzyme polymérase qui peut relier les éléments A, T, C et G aux amorces dans le bon ordre.
- Tampon : il s’agit d’un liquide dans lequel tous les composants sont dissous et qui fournit un environnement optimal pour la réaction.
Le processus de copie consiste en un cycle d’étapes répétées plusieurs fois. En général, 40 à 45 répétitions du cycle suffisent pour produire des milliards de copies. Faites le calcul : si vous prenez un morceau d’ADN, après le premier cycle vous avez deux copies, après le troisième cycle il y en a quatre, puis huit, 16, etc. La cuve de réaction et tous les composants sont placés dans un appareil qui peut chauffer et refroidir très précisément et rapidement. Un cycle consiste (généralement) en
- Dénaturation de l’ADN : l’ADN est composé des éléments A, T, C et G, qui forment un double brin d’ADN. Ces composés doivent être séparés, ce qui peut être fait en augmentant la température de 90 à 96°C.
- Une fois les brins séparés, les amorces peuvent commencer à se fixer au début et à la fin du morceau d’ADN à démontrer. Pour ce faire, la température est réduite entre 45 et 65°C.
- C’est maintenant au tour de l’enzyme polymérase de relier les blocs A, T, C et G des amorces attachées à une température de 72°C. La copie est faite !
Après chaque cycle, l’appareil enregistre la quantité de fluorescence mesurée. Si les amorces ne parviennent pas à trouver le morceau spécifique d’ADN, il ne se passe rien pendant tous ces cycles. La molécule fluorescente attachée à l’amorce reste éteinte. Lorsqu’une réaction a lieu, l’enzyme polymérase provoque la déconnexion de cette molécule pendant la copie. La molécule commence alors à émettre de la lumière, qui peut être mesurée à une certaine longueur d’onde par le dispositif PCR. La règle d’analyse est la suivante : plus la fluorescence mesurée est importante, plus le nombre de molécules présentes au début de la procédure de copie est élevé. Lors d’une détermination qualitative – l’ADN à examiner est-il présent oui ou non – l’analyste lit la valeur Ct (seuil). Cette valeur représente le cycle au cours duquel l’appareil commence à détecter la fluorescence. Une valeur Ct faible signifie donc qu’une grande quantité de matériel spécifique était présente dans l’échantillon isolé, mais rien ne peut être dit sur les quantités exactes. Dans certains cas, il est important de savoir non seulement si un fragment d’ADN spécifique est présent dans l’échantillon, mais aussi en quelle quantité. C’est ce qu’on appelle une PCR quantitative – également connue sous le nom de qPCR. Pour ce faire, outre l’échantillon à tester, il faut utiliser une série dont les concentrations sont connues et déterminer une courbe d’étalonnage. Cette courbe d’étalonnage permet de calculer la concentration initiale dans la cuve de réaction contenant l’ADN isolé.
L’un des principaux avantages de la technique PCR est qu’elle n’a théoriquement besoin que d’un seul morceau d’ADN spécifique pour déclencher la réaction et qu’elle est donc très sensible. Vous pouvez donc détecter une seule bactérie Legionella dans dix litres d’eau qui pourrait potentiellement causer une maladie. Ou vous pouvez détecter l’agent causal de la tuberculose, très difficile à cultiver, dans le mucus craché par le patient. Dans certains cas, cependant, l’inconvénient est que vous ne pouvez pas démontrer si l’organisme en question est encore vivant ou si vous analysez un fragment d’ADN d’un virus ou d’une bactérie qui ne peut plus causer de maladie parce qu’il est mort. En général, la réaction ne fait pas de distinction. Cette discussion a été fréquemment soulevée dans les médias lors de la détection du coronavirus et a suscité beaucoup de confusion et de critiques quant à l’utilisation de cette technique pour détecter le virus dans un écouvillon nasal et/ou pharyngé. Si la valeur Ct est élevée et qu’il y a peu de matériel initial du – dans ce cas – coronavirus, y a-t-il encore une infectiosité ? Est-il également possible que la PCR ne détecte pas de particules virales ou que le résultat soit positif alors qu’aucun virus n’était présent ?
Le risque d’obtenir un résultat faussement positif à partir d’un test PCR est assez faible. En revanche, le risque d’obtenir un résultat faussement négatif est plus élevé. En effet, il y a beaucoup plus de chances que des erreurs soient commises lors du prélèvement de l’échantillon, du transport ou des opérations dans le laboratoire. Ce n’est donc pas le test PCR qui donnera nécessairement des résultats faussement négatifs, mais toutes les actions qui l’entourent. Si vous avez accès à un test PCR et à l’équipement nécessaire pour détecter les transformateurs de maladies, la plupart des laboratoires opteront pour cette technique.
Marije, chef de laboratoire.
