La reazione a catena della polimerasi: la tecnica della PCR spiegata
Una tecnica comunemente utilizzata nei laboratori degli ospedali, delle università di medicina o delle fabbriche in cui vengono trattati ed esaminati alimenti o acqua, ad esempio, è la PCR. Questo metodo di ricerca relativamente giovane – sviluppato all’inizio degli anni ’80 – è stato rivoluzionario per il rilevamento e l’individuazione di organismi come batteri e virus. Per il rilevamento e l’esame del materiale genetico nelle indagini forensi, la tecnica della PCR è anche fondamentale per trovare un colpevole.
Dopo la pandemia della corona del 2019, nei telegiornali e nei relativi programmi informativi si è parlato molto del test PCR per la SARS-COV-2: il tipo di coronavirus responsabile della malattia COVID. Ma cos’è esattamente la PCR e come funziona? L’abbreviazione PCR sta per Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi). La polimerasi è un enzima, la catena è la parola inglese per “chain” e la parola reazione si traduce facilmente in “reaction”.
Si tratta quindi di una reazione a catena guidata da un particolare enzima, la polimerasi. Per spiegare quale reazione a catena è coinvolta, dobbiamo tornare alle basi e cioè al vettore di tutto il materiale ereditario: il DNA. Ogni cellula di un organismo vivente contiene il DNA (o un suo derivato) ed è composto da circa quattro diversi blocchi di costruzione: adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosio (C). Questi blocchi possono essere collegati tra loro in un numero infinito di combinazioni e queste combinazioni forniscono le proprietà ereditarie. Su un tale filamento di DNA – che è composto da questi elementi costitutivi – molte informazioni ereditarie corrispondono a un conspecifico. Tuttavia, ci sono sempre dei pezzetti (chiamati geni) sul filamento di DNA che sono molto specifici. Ad esempio, un batterio può sopravvivere in un ambiente acido mentre un altro no. Il batterio amante dell’acido produrrà sostanze che lo faranno sentire bene e l’acido non attaccherà la parete cellulare, mentre un altro batterio – che è un parente – non può e non sopravviverà in un ambiente acido.La tecnica della PCR utilizza il rilevamento di quei pezzi di DNA che sono molto specifici. È come cercare un ago in un pagliaio con diversi tipi di spilli, con i quali si può comunque estrarre quell’unico spillo speciale con un magnete molto forte. Il problema del DNA è che non è possibile vedere un solo pezzo di filamento ed è per questo che è stata sviluppata la reazione a catena. Milioni di copie vengono fatte di quell’unico pezzo di DNA specifico e, grazie a un trucco incorporato, le molecole fluorescenti si accendono o si spengono. Il grado di fluorescenza può essere misurato con determinate apparecchiature.
Il principio della reazione a catena della polimerasi
Lo scopo della reazione PCR è quello di moltiplicare lo specifico pezzo di materiale ereditario e rendere il risultato misurabile con la fluorescenza.
Ciò richiede una serie di componenti messi insieme in un recipiente di reazione:
- DNA isolato: DNA rilasciato da cellule presenti, ad esempio, nell’acqua, nel sangue o nel latte.
- I mattoni: adenina, timina, guanina e citosi
- Primer: frammenti di DNA che si attaccano all’inizio e alla fine del pezzo di materiale ereditario da copiare. A questi primer sono attaccate delle bandierine fluorescenti che sono “spente” quando non succede nulla nella reazione.
- Enzima: l’enzima polimerasi in grado di collegare i blocchi di costruzione A, T, C e G ai primer nell’ordine corretto.
- Tampone: si tratta di un liquido in cui sono disciolti tutti i componenti e che fornisce un ambiente ottimale per lo svolgimento della reazione.
Il processo di copiatura consiste in un ciclo di passaggi ripetuti più volte. In genere, sono sufficienti 40-45 ripetizioni del ciclo per produrre miliardi di copie. Fai i conti: se ipotizzi un pezzo di DNA, dopo il primo ciclo hai due copie, dopo il terzo ciclo quattro, poi otto, 16 e così via. Il recipiente di reazione con tutti i componenti è collocato in un dispositivo che può riscaldarsi e raffreddarsi in modo molto preciso e veloce. Un ciclo consiste (generalmente) in:
- Denaturazione del DNA: il DNA è composto dai blocchi A, T, C e G che formano un doppio filamento di DNA. Questi composti devono essere separati e questo può essere fatto aumentando la temperatura a 90-96°C.
- Una volta separati i filamenti, i primer possono iniziare ad attaccarsi all’inizio e alla fine del pezzo di DNA da dimostrare. Per fare ciò, la temperatura viene ridotta a 45-65°C.
- Ora tocca all’enzima polimerasi collegare i blocchi di costruzione A, T, C e G dei primer collegati a una temperatura di 72°C. La copia è fatta!
Dopo ogni ciclo, il dispositivo registra la quantità di fluorescenza misurata. Se i primer non riescono a trovare il pezzo di DNA specifico, non succede nulla durante tutti questi cicli. La molecola fluorescente attaccata al primer rimane “spenta”. Quando invece avviene una reazione, l’enzima polimerasi fa sì che la molecola si scolleghi durante la copiatura. La molecola inizia quindi a emettere luce, che può essere misurata a una certa lunghezza d’onda dal dispositivo PCR. La regola per l’analisi è: più fluorescenza viene misurata, più molecole erano presenti all’inizio della procedura di copiatura. In una determinazione qualitativa – il DNA da esaminare è presente sì o no – l’analista legge il valore Ct (soglia). Questo valore rappresenta il ciclo in cui il dispositivo inizia a rilevare la fluorescenza. Quindi un valore Ct basso significa che nel campione isolato era presente molto materiale specifico, ma non si può dire nulla sulle quantità esatte. Ci saranno anche situazioni in cui è importante sapere non solo se un determinato pezzo di DNA è presente nel campione, ma anche quanto. In questo caso si parla di PCR quantitativa, nota anche come qPCR. Per questo, oltre al campione da analizzare, è necessario utilizzare una serie in cui le concentrazioni siano note e determinare una curva di calibrazione. Utilizzando questa linea di calibrazione, è possibile calcolare quale fosse la concentrazione iniziale nel recipiente di reazione contenente il DNA isolato.
Uno dei principali vantaggi della tecnica PCR è che teoricamente ha bisogno di un solo pezzo di DNA specifico per avviare la reazione ed è quindi molto sensibile. In questo modo è possibile rilevare un solo batterio della legionella in dieci litri d’acqua che potrebbe potenzialmente causare malattie. Oppure si può individuare l’agente causale della tubercolosi, molto difficile da coltivare, nel muco tossito dal paziente. In alcuni casi, però, lo svantaggio è che non si può dimostrare se l’organismo in questione è ancora vivo o se si sta analizzando un frammento di DNA di un virus o di un batterio che in realtà non può più causare malattie perché è morto. In genere non viene fatta alcuna distinzione nella reazione. Questa discussione è stata spesso sollevata dai media quando è stato rilevato il coronavirus e ha causato molta confusione e critiche sull’uso di questa tecnica per rilevare il virus in un tampone nasale e/o della gola. Se il valore di Ct è elevato e il materiale iniziale del coronavirus – in questo caso – è scarso, c’è ancora infettività? E potrebbe anche accadere che con la PCR si perdano particelle di virus o che il risultato sia positivo anche se non è presente alcun virus?
Le probabilità di ottenere un risultato falso positivo da un test PCR sono piuttosto basse. Le probabilità di ottenere un test falso negativo, invece, sono più alte. Questo perché è molto più probabile che vengano commessi errori durante la raccolta del campione, il trasporto o le operazioni in laboratorio. Quindi non è il test PCR a dare necessariamente risultati falsi negativi, ma tutte le azioni che lo circondano. Se si ha accesso a un test PCR e alle attrezzature per rilevare i processori della malattia, la maggior parte dei laboratori opterà per questa tecnica.
Marije, responsabile del laboratorio.
