Reacción en cadena de la polimerasa: explicación de la técnica PCR
Una técnica muy utilizada en el laboratorio de hospitales, universidades médicas o fábricas donde se procesan y examinan alimentos o agua, por ejemplo, es la PCR. Este método de investigación relativamente joven -desarrollado a principios de los años 80- ha sido revolucionario para la detección y detección de organismos como bacterias y virus. Para la detección y examen de material genético en investigaciones forenses, la técnica PCR también es crucial para encontrar a un culpable.
Desde la pandemia corona de 2019, se ha hablado mucho en los noticiarios y programas informativos relacionados sobre la prueba PCR para el SARS-COV-2: el tipo de coronavirus responsable de la enfermedad COVID. Pero, ¿qué es exactamente la PCR y cómo funciona? La abreviatura PCR significa Reacción en Cadena de la Polimerasa. Polimerasa es una enzima, cadena es la palabra inglesa para “chain” (cadena) y la palabra reacción se traduce fácilmente por “reaction” (reacción).
Se trata, pues, de una reacción en cadena impulsada por una enzima concreta, la polimerasa. Para explicar de qué reacción en cadena se trata, tenemos que volver a lo básico y es el portador de todo el material hereditario: el ADN. Cada célula de un organismo vivo contiene ADN (o un derivado del mismo) y está compuesto por unos cuatro bloques de construcción diferentes: adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosa (C). Estos bloques de construcción pueden unirse entre sí en un número infinito de combinaciones y estas combinaciones proporcionan, en última instancia, las propiedades hereditarias. En dicha cadena de ADN -que está formada por esos bloques de construcción- mucha información hereditaria coincidirá con la de un congénere. Sin embargo, siempre hay fragmentos (llamados genes) en la cadena de ADN que son muy específicos. Por ejemplo, una bacteria puede sobrevivir en un medio ácido, mientras que otra no. La bacteria amante del ácido producirá sustancias que la harán sentirse bien y el ácido no atacará la pared celular, mientras que otra bacteria -que es un pariente- no puede y no sobrevivirá en un entorno ácido.La técnica PCR utiliza la detección de esos fragmentos de ADN que son muy específicos. Es como buscar una aguja en un pajar con diferentes tipos de alfileres, con los que aún puedes sacar ese único alfiler especial con un imán muy fuerte. El problema del ADN es que no puedes ver un trozo de hebra de ese tipo y por eso se desarrolló esa reacción en cadena. Se hacen millones de copias de ese único trozo de ADN específico y, con un truco incorporado, las moléculas fluorescentes se encienden o se apagan. Y el grado de fluorescencia puede medirse con determinados equipos.
El principio de la reacción en cadena de la polimerasa
El objetivo de la reacción PCR es multiplicar el fragmento específico de material hereditario y hacer que el resultado sea medible mediante fluorescencia.
Para ello es necesario reunir una serie de componentes en un recipiente de reacción:
- ADN aislado: ADN liberado de células presentes, por ejemplo, en el agua, la sangre o la leche.
- Los ladrillos: adenina, timina, guanina y citosis
- Cebadores: fragmentos de ADN que se adhieren al principio y al final del trozo de material hereditario que hay que copiar. Unidas a estos cebadores están las banderas fluorescentes que están “apagadas” cuando no les pasa nada en la reacción.
- Enzima: La enzima polimerasa que puede unir los bloques de construcción A, T, C y G a los cebadores en el orden correcto
- Tampón: Es un líquido en el que están disueltos todos los componentes y que proporciona un entorno óptimo para que se produzca la reacción en
El proceso de copia consiste en un ciclo de pasos que se repiten varias veces. Generalmente, basta con repetir el ciclo de 40 a 45 veces para producir miles de millones de copias. Haz el cálculo: si supones un trozo de ADN, después del primer ciclo tienes dos copias, después del tercer ciclo hay cuatro, luego ocho, 16, etc. El recipiente de reacción con todos los componentes se coloca en un dispositivo que puede calentarse y enfriarse con gran precisión y rapidez. Un ciclo consiste (generalmente) en:
- Desnaturalización del ADN: El ADN está compuesto por los compuestos A, T, C y G, que forman una doble cadena de ADN. Estos compuestos deben separarse y esto puede hacerse aumentando la temperatura de 90 a 96°C.
- Una vez separadas las hebras, los cebadores pueden empezar a unirse al principio y al final del trozo de ADN que se quiere demostrar. Para ello, se reduce la temperatura de 45 a 65°C.
- Ahora le toca a la enzima polimerasa unir los bloques de construcción A, T, C y G de los cebadores unidos a una temperatura de 72°C. ¡La copia está hecha!
Después de cada ciclo, el aparato registra cuánta fluorescencia se mide. Si los cebadores no encuentran el trozo específico de ADN, en realidad no ocurre nada durante todos esos ciclos. La molécula fluorescente unida al cebador permanece “apagada”. Cuando se produce una reacción, la enzima polimerasa hace que esa molécula se desconecte durante la copia. Entonces, la molécula empieza a emitir luz, que el aparato de PCR puede medir a una determinada longitud de onda. La regla al analizar es: cuanta más fluorescencia se mida, más moléculas estaban presentes al inicio del procedimiento de copia. En una determinación cualitativa -el ADN a examinar está presente sí o no-, el analista lee el valor Ct (umbral). Este valor representa el ciclo en el que el aparato empieza a detectar la fluorescencia. Por tanto, un valor Ct bajo significa que había mucho material específico en la muestra aislada, pero no se puede decir nada sobre las cantidades exactas. También habrá situaciones en las que sea importante saber no sólo si un fragmento concreto de ADN está presente en la muestra, sino también en qué cantidad. A esto lo llamamos PCR cuantitativa, también conocida como qPCR. Para ello, además de la muestra que se va a analizar, hay que utilizar una serie en la que se conozcan las concentraciones y se determine una curva de calibración. Utilizando esa recta de calibración, es posible calcular cuál era la concentración inicial en el recipiente de reacción que contiene el ADN aislado.
Una gran ventaja de la técnica PCR es que teóricamente sólo necesita un fragmento de ADN específico para iniciar la reacción y, por tanto, es muy sensible. Así que puedes detectar sólo esa bacteria Legionella en diez litros de agua que podría causar la enfermedad. O puedes detectar ese agente causal de la tuberculosis tan difícil de cultivar en la mucosidad expectorada del paciente. En algunos casos, sin embargo, el inconveniente es que no puedes demostrar si el organismo en cuestión sigue vivo o si estás analizando un fragmento de ADN de un virus o una bacteria que en realidad ya no puede causar la enfermedad porque está muerto. Por lo general, esto no se distingue en la reacción. Este debate se planteó con frecuencia en los medios de comunicación cuando se detectó el coronavirus y provocó mucha confusión y críticas sobre el uso de esta técnica para detectar el virus en un frotis nasal y/o faríngeo. Si hay un valor Ct elevado y había poco material inicial del -en este caso- coronavirus, ¿sigue habiendo infecciosidad? ¿Y también podría darse el caso de que se pasen por alto partículas de virus con la PCR o que el resultado sea positivo aunque no hubiera virus presente?
Las probabilidades de obtener un resultado falso positivo de una prueba PCR son bastante bajas. Sin embargo, la probabilidad de obtener un falso negativo es mayor. Esto se debe a que hay muchas más posibilidades de que se cometan errores durante la recogida de muestras, el transporte o durante las operaciones en el laboratorio. Por tanto, no es la prueba PCR la que dará necesariamente resultados falsos negativos, sino todas las acciones que la rodean. Si tienes acceso a una prueba PCR y a equipos para detectar procesadores de la enfermedad, la mayoría de los laboratorios optarán por esta técnica.
Marije, Jefa de Laboratorio.
